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克隆、轉化相關問題

發布者:莊盟生物發布時間:2015-04-09瀏覽次數:3420次
保證亞克隆實驗成功需做的照實驗

為使亞克隆實驗成功,并能在未獲得目的克隆時,查明實驗失敗的原因,每次實驗應包括相應的對照。其中包括:

感受態細胞的轉化效率

抗菌素是否有效

連接的效率

未連接質粒的背景

磷酸酶處理的效果


檢測感受態細胞的效果需作的照實驗
為保證宿主細胞是感受態細胞,而且無污染,需作2個試驗。
一、取1管分裝的感受態細胞,不作轉化(比如不加DNA,但和實驗樣品平行處理),將等量的細菌涂布到含抗菌素和不含抗菌素的平板上。含抗菌素的平板應無菌落生長,生長有菌落就表明污染了質粒或抗菌素失效,為區別可從生長的菌落中提取質粒,以鑒別原因。不含抗菌素的平板上應生長了許多菌落,甚至菌落群,反之表明細菌無活力。
二、確定感受態細胞的轉化效率。將一定量的完整質粒轉化到感受態細胞中,取一部分轉化的細菌,涂布到選擇培養基上,可用菌落生長單位/mgDNA,按下面的方法計算感受態細胞的轉化效率:用0.1ng完整的質粒DNA轉化100ml的感受態細胞,向轉化反應液中加入900 ml培養液(0.1ng/1ml),讓細菌恢復一小段時間(1小時)。將轉化反應用培養液作1:10的稀釋(0.01ng/ml),取其中100ml的稀釋液來涂布(0.001ngDNA/100ml)。如能獲得200個克隆,轉化效率是2×108 cfu/mgDNA,計算方法如下: 200cfu/0.001ng=2×105 cfu/ng=2×108cfu/mgDNA

轉化效率1×106 cfu/mgDNA可滿足普通的亞克隆實驗;1×107 cfu/mgDNA用于作更復雜的亞克隆,有限量的DNA的轉化,T-克隆實驗;構建文庫和突變要求用的轉化的效率為>1×108 cfu/mgDNA。


選擇宿主菌株的因素
1、 所選的宿主菌株對所用質粒的抗生素抗型基因敏感;如進行藍/白斑篩選,宿主菌β-半乳糖苷酶的α-肽編碼區應在染色體或附加體上缺失掉( lac ZΔM15)。為Top10和DH5α能用于藍/白斑篩選;。
2、 表達重組的蛋白和融合蛋白,應使用帶T7 RNA聚合酶基因的菌株,如BL21(DE3)。特別是重組的蛋白對大腸桿菌有毒時;
3、 進行突變實驗時,應選錯配修復缺陷型菌株使突變的子鏈能復制( mut S菌株);

4、 使用pGEM載體克隆大片段時(>7-8Kb),轉化時菌株在30℃而不是37℃生長,更有利于細胞的復蘇。


檢測連接反應的效果需做的對照實驗

為檢測連接反應的效果,線化(單限制性酶切,非磷酸酶處理)質粒需同實驗樣品平行連接。取一部分連接反應液用于轉化,隨后涂布到選擇培養基上。平板上所生長的菌落數,可同相同量、未連接的線化質粒、轉化相同數目的細菌后,涂布在選擇培養基上所生長的菌落數比較。如果連接成功,自連接質粒在平板上的菌落數,會遠遠高于未連接的線化質粒轉化細菌所得的菌落數。如果線化成功,未連接的線化質粒(未連接的質粒背景)所得的菌落數應很低。如連接效率高,則自連質粒所得的菌落數應同用完整質粒轉化細菌所得的菌落數相近。 另一種非定量的方法是將等量的未連接質粒和連接質粒在瓊脂上電泳,連接后的樣品的遷移率會降低。


怎樣提高連接轉化效率?

1.確認Insert DNA片段的3'末端是否帶有“A”尾。大部分的高保真DNA聚合酶(如:Pyrobest、PrimeSTAR HS、KOD、Pfx、Pfu等)擴增的PCR產物是平滑末端,不能直接進行TA克隆。

2.純化PCR產物。最好使用切膠回收的PCR片段,以除去PCR產物中的非特異性片段和引物等雜質。進行切膠回收時可以使用莊盟是生物的小量瓊脂糖凝膠回收試劑盒(ZP202)。

3.請使用轉化效率大于108cfu/μg pUC19 DNA的感受態細胞。

4.DNA片段的立體結構、DNA片段的長短都會影響克隆效率。一般情況下,大片段DNA的克隆效率(連接效率與轉化效率)偏低,此時可以延長連接反應時間,或采用電轉化方法。

5.進行切膠回收純化DNA片段時,不要使DNA片段在紫外線下暴露時間過長。

6.建議使用新配制的平板培養基。


陽性克隆鑒定方法有哪些?

1.藍白斑篩選。

藍白斑篩選是重組子篩選的一種方法,一般情況下,β-半乳糖苷酶的表達將受到破壞,重組克隆體在含有X-Gal、IPTG、Amp的L-瓊脂平板培養基上培養時將顯示白色菌落。但有時比較短的DNA片段插入載體時,基因的讀碼框有可能正好與LacZ的讀碼框相吻合,克隆體也會顯示藍色菌落。有報道稱,2 kbp的DNA片段插入到載體中后,重組克隆體仍顯示了藍色。所以,當我們沒有得到白色菌落時,可以試著檢測藍色菌落。

2.菌落PCR方法。

以變性后的菌液為模板,使用載體通用引物進行PCR擴增鑒定。

使用滅菌后的牙簽挑取白色菌落,在預備好的ddH2O(10μl)中蘸洗,99℃,10 min變性,冰上急冷,加入配制好的PCR混合液(引物,dNTP,Buffer, Taq等)。

94℃   1 min

94℃   30 sec

55℃   30 sec        30 Cycles

72℃   1 kbp/min

說明: a.所用引物通常為載體通用引物。

b.擴增產物的大小為載體通用引物之間大小+插入片段大小。
3.質粒PCR方法。

以提純后的質粒DNA為模板,使用PCR擴增引物進行PCR擴增鑒定。

94℃   1 min

94℃   30 sec

55℃   30 sec       30 Cycles

72℃   1 kbp/min

說明:擴增產物的大小就是PCR產物的大小。

4.酶切方法。

利用載體多克隆位點上限制酶或者PCR引物導入酶切位點的限制酶,對提純后的質粒DNA進 行雙酶切鑒定。 說明:雙酶切后,電泳顯示兩條帶,分別為載體大小和PCR產物的大小。


藍白斑篩選原理及問題總結

1 問題:做轉化時,用藍白斑篩選,以獲得陽性克隆。那它和直接利用AMP抗性,而不用藍白斑篩選,有什么區別嗎?藍白斑篩選有什么作用嗎?

對于這一問題,我想,抗性篩選是防止雜菌生長。理論上說,當培養基中含有抗生素時,只有攜帶相應抗藥性基因載體的細胞才能生存繁殖。藍白篩選是驗證是否有插入片斷。兩者結合起來,更有利于篩選到我們的目的菌。


2 問題:如果加了AMP、IPTG和X-Gal,長出來的白斑一定都是含有插入片段的嗎?有沒有可能是載體自連的?

答:可以說,世界上沒有絕對的事情,即使加了AMP、IPTG和X-Gal,長出來的白斑也不一定都是含有插入片段的陽性克隆,具體原因可能有:
1)有可能是載體自連的假陽性;
2)作時AMP、IPTG和X-Gal其中一種或幾種沒涂均勻。
3)有時即使插入片段也會出現籃斑。只要編碼框沒被破壞。


3 問題:如何篩選重組菌落?

答:可使用藍/白斑篩選法,在涂布有IPTG和X-Gal的篩選平板上,重組菌株為白色,未轉入重組質粒的菌株為藍色。


4 問題:藍白斑篩選如何篩選合適的宿主菌株?

答:如進行藍/白斑篩選,宿主菌β-半乳糖苷酶的α-肽編碼區應在染色體或附加體上缺失掉(lacZΔΜ15)。TOP10和DH5α都能用于藍/白斑篩選。


5 問題:在藍白斑篩選的過程中沒有藍斑是什么原因導致的?因為通過PCR檢測插入片段的大小表明所挑的白斑克隆并沒有插入片段。

答:原因很多,

1)可能是你用的培養基含有乳糖或葡萄糖,因為半乳糖甘酶會分解乳糖,導致不能與X-Gal反應,葡萄糖不會誘導融合基因的表達。

2)作時AMPIPTGX-Gal其中一種或幾種沒涂均勻。

3)很多因素會造成PCR失敗。


6 問題:我最近轉化大腸桿菌時,通過藍白斑篩選,挑出白色菌落做PCR,可是在電泳時發現在有目的帶的同時還有比目的帶小的雜帶,不知為什么?我反復篩了幾次,都是這樣,可不可以搖菌提質粒?我應該下一步怎么做?

答:針對這樣的情況,我覺得,你首先做酶切鑒定,看看你的目的片段是否真正插入。其次,你應該檢測PCR過程有沒有問題。


7 問題:我用Amp-IPTG-X-gal LB平板進行藍白斑篩選重組子,為何篩出的全是白斑,沒一個藍斑,挑幾個白斑搖菌擴增后PCR檢測也全是陽性克隆,不會全都重組成功了吧?什么原因呢?

答:這樣的情況是完全有可能的,只要載體處理的好,應該說是有這種可能。


藍白斑篩選原理:
   
藍白斑篩選是根據載體的遺傳特征篩選重組子,如α-互補、抗生素基因等。現在使用的許多載體都帶有一個大腸桿菌的DNA的短區段,其中有β-半乳糖苷酶基因(lacZ)的調控序列和前146個氨基酸的編碼信息。在這個編碼區中插入了一個多克隆位點(MCS),它并不破壞讀框,但可使少數幾個氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影響功能,這種載體適用于可編碼β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主細胞。因此,宿主和質粒編碼的片段雖都沒有酶活性,但它們同時存在時,可形成具有酶學活性的蛋白質。這樣,lacZ基因在缺少近操縱基因區段的宿主細胞與帶有完整近操縱基因區段的質粒之間實現了互補,稱為α-互補。由α-互補而產生的LacZ+細菌在誘導劑IPTG的作用下,在生色底物X-Gal存在時產生藍色菌落,因而易于識別。然而,當外源DNA插入到質粒的多克隆位點后,幾乎不可避免地導致無α-互補能力的氨基端片段,使得帶有重組質粒的細菌形成白色菌落。這種重組子的篩選,又稱為藍白斑篩選。如用藍白斑篩選則經連接產物轉化的鈣化菌平板37溫箱倒置培養12-16hr后,有重組質粒的細菌形成白色菌落。
IPTG
X-Gal介紹
    IPTGIsopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside,也稱Isopropyl β-D-thiogalactoside,中文名為異丙基-β-D-硫代半乳糖苷。分子式為C9H18O5S ,分子量為238.30CAS Number 367-93-1Ultra Puredioxane free,常用于藍白斑篩選,如果在平板培養基中加入X–GalIPTG,由于β–半乳糖苷酶的α–互補性,可以根據是否呈現白色菌落(或噬菌斑)而方便地挑選出基因重組體。此外,它還可以作為具有lactac等啟動子的表達載體的表達誘導物使用。
   X-Gal:中文名為5--4--3-吲哚-β-D-半乳糖苷。X-Galβ-半乳糖苷酶(β-galactosidase)的顯色底物,β-半乳糖苷酶的催化下會產生藍色產物。常用于β-半乳糖苷酶的原位染色檢測以及藍白斑篩選。
IPTG
X-Gal配置
IPTG配制成24 mg/ml100 mM)的水溶液,并進行過濾除菌后保存。
X-gal
用二基甲酰胺DMF溶解X-gal配制成的20mg/ml的貯存液。保存于一玻璃管或聚丙烯管中,裝有X-gal溶液的試管須用鋁箔封裹以防因受光照而被破壞,并應貯存于-20X-gal溶液無須過濾除菌。
使用方法:
  100 ml的瓊脂培養基中,當培養基溫度為55左右時,加入100 μl24 mg/ml100 mMIPTG200 μlX-Gal20 mg/ml)和100 μlAmp100 mg/ml),制作成IPTGX-GalAmp平板培養基。


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